我国低聚木糖的产量和纯度与国外相比差距很大,其中主要的技术难题之一就是低聚木糖的分离提纯,目前还没有既经济又有效的分离纯化方法。因此,利用先进的分离技术如层析技术和膜分离技术改进低聚木糖的分离纯化工艺,以提高产品质量和降低生产成本是目前研究的重点和热点。同时,随着低聚木糖研究工作的开展,木二糖~木七糖标准品的缺乏使得低聚木糖的研究工作受到了严重影响,因此,探索低聚木糖单一组分分离纯化的工艺,以制备分离出低聚木糖单一组分(木二糖~木七糖)用作分析标样,同时用于低聚木糖单一组分生理活性的研究无疑都具有重要的意义。低聚木糖(xylooligosaccharides)是一种非消化性低聚糖,能选择性增殖肠道内的双歧杆菌,是一种优良的双歧杆菌增殖因子,故又被称为双歧因子。其独特的生理活性和良好的理化特性使得低聚木糖被认为是目前最有前途的功能性低聚糖之一。
低聚木糖已被作为功能性食品基料而广泛应用于食品工业"在日本,超过半数的“特定保健食品”种类中添加了低聚木糖,低聚木糖尤其适宜用作糖尿病、肥胖症病人的甜味剂。低聚木糖用作饲料添加剂具有增强动物免疫力,提高动物生产性能的功效,并且具有用量少、无污染、无残留等特点,因此低聚木糖饲料添加剂具有广阔的应用前景。南京林业大学在国内外首次成功开发出低成本的低聚木糖饲料添加剂,该产品具有增产增质,提高免疫力,预防疾病,无公害等一系列优点。
1、低聚木糖的脱色
目前,工业生产低聚木糖主要是采用微生物酶法。在低聚木糖的生产过程中,随着原料和木聚糖酶的来源不同,其产品的组成及含量有所不同。低聚木糖产品成分主要是中性低聚木糖,其次是少量的酸性低聚木糖,此外还含有少量的木糖、聚合度(DP)大于8的木聚糖、木质素、酶蛋白、色素等物质,其中只有聚合度为2~7的低聚木糖属于生物活性物质。
我国低聚木糖的制备多以玉米芯为原料,因此低聚木糖中色素主要有两个方面的来源。首先是玉米芯含有的天然花色苷和含氮物质,它们在对原料进行处理如碱抽提或蒸煮时进入到产品中;其次是呈色反应所产生的色素,主要的呈色反应有糖类的焦糖化反应产生的焦糖色素!还原糖与氨基酸的美拉德反应产生的类黑精色素以及木糖等还原糖酸降解产生糖降解色素等。
低聚木糖的脱色是低聚木糖生产过程中遇到的难点之一,目前虽然进行了许多研究,但存在脱色效果和低聚木糖损失难以两全的矛盾。脱除色素主要采用的方法有活性碳吸附、离子交换树脂吸附、絮凝剂脱色等。
2、低聚木糖的层析分离
⑴凝胶过滤层析
凝胶过滤层析被广泛应用于低聚糖及其降解产物的分离和分析。在常见的几种凝胶(葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶)层析分离技术中,聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Gel)层析是低聚糖分离的主要技术之一。
凝胶层析中用于低聚糖分离较多的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶Bio-GelP-2。Bio-GelP-2在20世纪70年代就曾用于低聚木糖的分离,后来也出现了许多关于Bio-GelP-2对低聚木糖进行分离的研究报道。Harry等在研究小麦碱抽提所得阿拉伯木聚糖的糖基组成及结构时,将该木聚糖用内切木聚糖酶酶解后,采用Bio-GelP-2凝胶柱层析技术,在柱型为100×2.6cm I.D.,柱温60℃,以蒸馏水为洗脱液,在流速为17ml/h的条件下分离酶解所得的带阿拉伯糖基的低聚木糖,然后采用HPAEC和1H-NMR等技术对各组分所含的糖基种类、含量及连接键型进行了分析。
聚丙烯酰胺凝胶Bio-GelP-4层析技术已被证实可用于低聚木糖、麦芽低聚糖和葡低聚糖的分离。Michael等采用Bio-GelP-4凝胶,在柱型为210×2.54cmI.D.,凝胶为400目,柱温为60℃,以脱气水为洗脱液,在流速为55ml/h的情况下能将低聚木糖和低聚麦芽糖很好的分离,而且既可以用于低聚糖的分析也可用于低聚糖的制备。Marvin等采用两根串联的Bio-GelP-4凝胶柱,每根柱型均为100×0.6cmI.D.,凝胶为400目,柱温为55℃,以水为洗脱液,在流速为18ml/h的条件下3h内可将葡低聚糖很好的分离,实验证明该方法可用于糖蛋白酶解低聚糖的分析,而且该凝胶柱在9个月内连续分离了300多个样品后仍然相当稳定。
⑵离子交换层析
AminexHPX-42型阳离子交换树脂可用于低聚木糖、低聚异麦芽糖和纤维寡糖的分析,此法可在1h内分离聚合度达到9的低聚糖,与Bio-GelP-2凝胶层析技术相比,具有分析时间短及单糖分离效果好等优点。Mitsuro等用强碱性阴离子交换树脂(AG1×8,OAc-,Bio-Rad)用于低聚木糖液中酸性低聚糖和中性低聚糖的分离,他们将中性低聚木糖用水洗出,随后用5mol/L的乙酸将酸性低聚木糖洗脱出来。
⑶吸附层析
活性碳柱层析技术早在20世纪40年代初就用于糖类分离。50年代初,Whistler等作了改进,采用活性碳2硅藻土或活性碳-Al2O3为吸附剂,以0~15%的乙醇溶液梯度洗脱,使木糖、木二糖、木三糖、木四糖和木五糖之间得到分离,此法具有分离容量大!适用范围广等优点。Waniska等比较了超滤、凝胶层析和吸附层析对玉米糖浆中葡低聚糖DP5~10和10~20的分离效果,超滤膜采用PM10、UM10和UM2,凝胶层析采用Bio-GelP-2作为分离介质,吸附层析采用活性碳-硅藻土为介质以乙醇溶液梯度洗脱,结果他得出了吸附层析分离葡低聚糖效率最高的结论。Shuichi等采用0~25%的乙醇溶液进行线性梯度洗脱,用活性碳柱层析分离了乳糖醇经半乳糖苷酶酶解后的低聚糖产物,并对所分离的低聚糖进行了结构分析。
3、低聚木糖的膜分离
膜分离技术是一种新兴的高效分离、浓缩和提纯技术,由于该技术具有常温、无相变、高效、节能、无污染等特点,因此,近30年来在食品加工、医药、生物化工等领域获得了较大发展。膜分离技术主要分为微滤(MF)、超滤(UF)、纳滤(NF)、反渗透(RO)、透析(DS)、电渗析(ED)和渗透汽化(PV)等。用于低聚糖分离的膜技术主要有超滤、纳滤和反渗透。
超滤可去除大分子物质或固体微粒,根据其膜孔径的大小,还可用于低聚糖的分级分离。Mitsuro等利用截留不同分子质量的超滤膜对低聚木糖进行了分级处理,分析结果显示,截留分子质量小于500的膜所得级分主要为木糖和木二糖,截留分子质量大于500而小于1000的膜所得级分为木四糖和木五糖,截留分子质量大于1000而小于5000的膜所得级分主要为木七糖和木八糖。Waniska等]也曾将超滤膜PM10、UM10和UM2用于玉米糖浆DP5~10和10~20的分级分离研究。
纳滤在过滤分离时,能在截留小分子有机物的同时,透析出盐,即集浓缩与透析为一体。Urano等对纳滤膜用于低聚糖分离的规律进行了研究,并将4种不同的纳滤膜(G5、G10、G20、G50)对从耶露撒冷洋蓟中提取的低聚果糖进行了分离,结果表明,G50能除去分子质量大于10000Da的大分子,其它三种纳滤膜能将低聚果糖按分子质量的大小依次分离。从母乳中除去乳糖以纯化活性低聚糖的传统方式是凝胶过滤层析,此法处理量小,处理时间长。Douglas等将脱脂母乳用β-半乳糖苷酶将乳糖转化为葡萄糖和半乳糖后,利用纳滤膜纯化,经过四次循环低聚糖的收率超过50%,此法还可推广到羊乳中三糖!四糖的分离纯化。Athanasios等研究了两种纳滤膜(NF-CA-50和NF-TFC-50)和一种超滤膜(UF-CA-1)对单糖、低聚糖的分离特性,结果表明两种纳滤膜可有效分离单糖和二糖,其中NF-TFC-50纳滤膜用于低聚糖混合物分离时可除去81%的单糖而保留88%的低聚糖,其分离特性满足低聚糖分离纯化的要求。超滤膜UF-CA-1在除去88%单糖的同时会损失47%的低聚糖,其分离效果不理想。
超滤-纳滤两种膜技术结合用于低聚糖的分离纯化也较为广泛。菊苣根生产低聚果糖的过程中,其水抽提物经过预过滤后,用超滤膜过滤以除去大分子物质如蛋白质、淀粉、纤维和不溶性物质,然后将超滤透过液置于纳滤膜中循环以除去部分单糖、双糖(果糖、葡萄糖和蔗糖)和盐,结果纳滤截留液中的单糖和二糖含量可从9.0%降至2.6%,而透过液中的盐浓度由24.3mg／ml增至144mg／ml,最终产品得到纯化和浓缩。在大豆蛋白生产过程中会排放出大量的大豆乳清废液,利用膜技术对其进行处理,不仅可以回收大豆低聚糖和可溶性蛋白,而且能减少污染。Yasuhito等研究了超滤-反渗透和超滤-纳滤两种回收大豆低聚糖的方案。首先采用超滤膜除去蛋白质和聚糖,若超滤透过液采用反渗透膜浓缩,则糖液被浓缩近15倍,透过液的化学需氧量从6400×10-6(ppm)降到27×10-6,满足直接排放的要求;若超滤透过液采用纳滤浓缩,糖液被浓缩近31倍,透过液的化学需氧量为160×10-6,刚好满足排放要求。分析表明纳滤膜所回收的大豆低聚糖质量高于市售产品,而且其浓缩效果好于反渗透。因此他得出结论,采用超滤-纳滤法回收大豆低聚糖较为可取。
4、低聚木糖的生物法分离
除常规的理化分离方法外,还可通过生物发酵法将功能性低聚糖中的非功效组分选择性除去。Isao等利用酵母(Candidaparapsilosisvar.komabaensisK275)在30℃条件下发酵木糖和木二糖的混合溶液2.5d后,可将混合液中的木糖选择性发酵而去除,离心除去酵母后便得到了纯化的木二糖溶液.酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)可以将功能性低聚糖混合物中的葡萄糖发酵成酒精而除去,利用此法纯化低聚异麦芽糖,可使其纯度超过90%,Koren等曾利用此法将果糖提纯到100%。
5、问题与展望
尽管近年来低聚木糖的生产技术取得了较大的进展,而其分离提纯技术一直没有取得更大的突破,主要存在色泽深!产品纯度难以提高或提纯所需成本过高等问题,因此低聚木糖的分离纯化是其成本过高的主要障碍。而随着先进膜产品和层析填料的研究与开发,膜技术及层析技术用于低聚木糖的分离纯化必将是以后高效低能提纯低聚木糖的有力措施。
在低聚木糖生产和应用研究过程中,需要低聚木糖单一组分的标准样品用于低聚木糖的分析。而低聚木糖各单一组分除分子质量有所差别外,其它理化性质都比较接近,导致单一组分分离困难,结果导致市场上低聚木糖的标样缺乏,部分产品售价较高。以目前市场上仅有的木二糖为例,其售价竟高达2000元人民币/5mg,合40万元/g。根据低聚木糖单一组分的理化特性,除采用层析分离技术外,目前尚无其它更为有效的分离方法,适于低聚木糖单一组分制备分离的层析技术主要有凝胶过滤层析和吸附层析两种。两种层析分离技术各有优缺点,凝胶过滤介质较昂贵,但可反复使用,一般用水作为洗脱剂等度洗脱;吸附层析所使用介质相对便宜,样品容量大,但不能采用等度洗脱的方式,不能用示差检测,而且周期比较长。
山东龙力生物科技股份有限公司是目前中国最大的低聚木糖生产厂家，年生产能力达到4000吨，并可以生产95%以上的高纯度低聚木糖，是低聚木糖行业标准的主起草单位，拥有低聚木糖发明专利5项。

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